人臍靜脈細胞HUVEC的實驗步驟是怎樣的？　

　　人臍靜脈細胞HUVEC是從臍帶組織中分離出來的；它是臍帶的重要結構細胞之一，在人體的正常生理過程中發揮著重要作用。臍帶是連接哺乳動物的胎兒和胎盤的管狀結構。臍帶中穿過尿道膜的血管是臍動脈和臍靜脈，卵黃囊中的血管是臍腸系膜動脈和臍腸系膜靜脈。在子宮內，來自胎盤母親部分的子宮動脈的毛細血管與胎盤女兒部分的胎兒毛細血管接近，母親和胎兒的血液在這里進行二氧化碳和氧氣的交換，代謝物是代謝廢物和營養物質。臍動脈將胎兒產生的廢物輸送到胎盤，而臍靜脈將O2和營養物質從胎盤輸送到胎兒體內。

 

　　人臍靜脈細胞HUVEC是通過胰蛋白酶膠原酶聯合消化法結合差異化粘附法制備的，并在內皮細胞專用培養基中進行了培養和篩選。細胞總數約為5×10^5個/瓶；細胞經CD31/vWF免疫熒光鑒定，純度達90%以上，無HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌。
 

       人臍靜脈細胞HUVEC的實驗步驟

　　1、將15-20cm長的新生兒臍帶放入無菌PBS溶液中保存。(注意：在4℃下最多可保存24小時，室溫下可保存6小時，否則將被丟棄）。

　　2、將鈍針插入臍靜脈管，用無菌PBS液沖洗3-5次，直至污染的血液干凈。

　　3、用手術鉗夾住臍帶下端，加入15ml膠原酶（1mg/ml）在室溫下消化15-20分鐘，并不時上下搖晃臍帶。

　　4、消化結束后，松開下面的手術鉗，將消化液流入50ml無菌離心管，用無菌PBS溶液沖洗臍帶2-3次。

　　5、將收集的溶液離心（2000rpm）3分鐘。

　　6、取出上清液，加入10mlM199培養基（加入10U/ml的bFGF），用肘部吹去細胞，將所有液體轉移到用明膠包裹的培養瓶中，在37℃下培養（注：每個培養瓶中加入3-4ml無菌1%明膠溶液，搖勻使明膠溶液*覆蓋瓶底，37℃下培養至少2小時。使用前倒掉明膠溶液。明膠涂層有利于細胞壁的粘附）。

　　7、培養24小時后，倒出培養基，用無菌PBS溶液洗2-3次，洗去紅細胞和死細胞，加入10ml新鮮M199培養基。

　　8、每2天更換一次培養基（每次更換2/3的培養基）。

　　9、一般來說，經過5-7天的培養，細胞可以生長到80-90%的單層，可以傳代。

　　10、人臍靜脈細胞HUVEC倒出培養基，用無菌PBS溶液洗2-3次，加入2-3毫升消化液（0.25%胰蛋白酶+0.1%EDTA）消化細胞，在顯微鏡下觀察。一旦細胞變圓，加入2-3次含血清的DMEM培養基以停止反應。

　　11、用肘部吹干細胞，將消化后的細胞轉移到50ml無菌離心管中，2000rpm，離心3分鐘。

　　12、倒出上清液，加入10毫升新鮮培養基。一般來說，3-4瓶細胞可以在一個瓶子里進行傳代培養，然后像這樣進行傳代培養。

　　13、一般來說，通過2-3代（約20天）進行各種實驗。